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今天是2023年1月26日，大年初五，按照传统习俗， 今日迎财神！~~
初一、初二、初三，我们先后分享了兔年诞生的8家药企 、有价值有温度药味十足的精彩活动 、医药相声《缘满兔儿年！》 。今天我们继续 兔年说兔 。
今天，我们隆重转发推荐荃信生物于2021年3月7日发表的精彩文章，《 大咖专访 | 别有洞天的兔单克隆抗体世界，且听余国良博士娓娓道来！ 》，与广大同药们分享、共勉！ 一起 迎财神！~~
大咖专访‖
别有洞天的兔单克隆抗体世界
编者按：
抗体，早已是全球各国生物医药发展所必须的生物材料，更是学术界和技术企业要抢占的战略制高点，广泛应用于科研，疾病的预防、诊断和治疗。对于单克隆抗体（单抗），大家喜闻乐道的常常是鼠单抗，以及基于鼠单抗做了人源化改造的嵌合抗体、人源化抗体，还有越来越多的全人源抗体等。但对于兔单抗，尤其是兔单抗发展的历史背景、发展历程、兔单抗的优势与特点、兔单抗技术发展趋势，以及兔单抗在临床治疗领域的应用等，定有你不知道而又渴望知道的，下面且听余国良博士跟您娓娓道来这些有趣的故事。
余国良 博士
▊ 兔源抗体非常好，兔单抗研发也很早被探索，但早期杂交瘤不稳定
动物的浆细胞会针对某一个抗原产生很多很多种的抗体。抗体和抗原独特的结合点称为表位。所谓单克隆抗体就是某一个浆细胞产生的一种特定的抗体，只识别特定的表位。1975年，塞萨尔·米尔斯坦(César Milstein)和乔治·科勒(Georges Köhler) 发现将小鼠骨髓瘤细胞和免疫的小鼠脾细胞融合，形成的杂交瘤细胞。分离出来的单克隆细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而发现了单抗杂交瘤技术，并获得了1984年诺贝尔奖。当然，现在我们知道，除了杂交瘤技术之外，后来还发展了很多种基因工程技术来制备单克隆抗体。
为什么要用一种肿瘤细胞来做单克隆抗体呢？因为肿瘤细胞是永生的，所以当你把分泌抗体的B细胞和肿瘤细胞融合了以后的融合细胞也是永生的，会源源不断地产生抗体。杂交瘤技术的经典之处，就是人类第一次可以在体外大量地获得单抗，这个是划时代意义的突破。那么我们现在技术比较高级的方法就是把抗体基因找出来直接转到CHO细胞（注：工程化的重组蛋白表达宿主细胞），现在产业界也确实也是这么做的。
当时我们只能在小鼠和大鼠上做鼠源的抗体。但是我们又发现，许多鼠源抗体是有不足之处的，不但功能不齐全，而且质量是相对不够好的。以前我们做科研需要用到抗体的时候，第一反应是去免疫兔子，也就是获得兔多克隆抗体。许多人觉得兔子的多抗特别好，只是没有办法把它变成单抗，只有鼠源抗体是可以是单抗。这样历史上大部分开发的单抗都是鼠源的，直到后来我们在2000年代把兔单抗发掘出来。
鼠杂交瘤技术被开发出来后，人们为兔单克隆抗体技术进行了许多尝试。尝试的过程就是液体的瘤细胞能够比较有效地和产生抗体的B细胞进行融合，融合以后产生的细胞株又能够长期稳定。这样的尝试过程类似于所有科学技术探索过程一样，都是有很多前人在不断尝试，不断失败中学习摸索，直到某一天，有一个人成功了。
1995年，芝加哥洛约拉大学（Loyola University）的凯瑟琳·奈特教授（Dr. Katherine Knight）用过量表达两个致癌基因v-abl和c-myc的双转基因兔成功培育出可以做为融合细胞的兔骨髓瘤细胞株，即240E-1，成为了产生兔单克隆抗体的首个融合细胞。虽然这是一个重要的里程碑，但奈特教授的文章发表了之后并没有广泛受到重视，这是因为稳定性的问题，往往好不容易做了融合得到的杂交瘤就给弄丢了（注：融合杂交瘤把抗体基因丢失使其不能稳定产生单克隆抗体）。
兔骨髓瘤细胞株240E-1[1]
▋ 科学家的“死磕”，解决了兔杂交瘤细胞稳定性的问题
当时我参与的人类基因组和基因表达组刚刚取得阶段性成果，之后就特别想做蛋白组，就选择用一个抗体平台研究人类蛋白组，于是有了后来Epitomics以及和朱伟民、柯耀煌等兔抗体技术大佬的故事。
1996年，在加州大学旧金山分校的朱伟民和罗布特·派特拉教授（Dr. Robert Pytela）遇到一个技术难题，他们需要针对一种细胞嵌入因子制备一个抗体。可是用小鼠做的抗体就是不够好使。他们听说Katherine Knight有一个兔浆细胞瘤细胞系，就从Knight博士的实验室获得了240E-1，朱伟民拿了这个细胞系做了好几个的抗体，这可是他当时他认为见过的最好的抗体。
这就是说，不仅仅用老鼠能做出单克隆抗体，现在用兔子也可以得到单克隆抗体啦！我们知道动物和动物之间的免疫反应是有差异的，兔免疫系统比鼠免疫系统要强大，所以抗体就更好。兔子的单抗和杂交瘤可以有，只是当时的技术不成熟，产生的杂交瘤不稳定。做为一个需要广泛应用的技术平台不完美。
朱伟民说，他要把不完美的技术做成完美的，想把兔骨髓瘤技术做得可以工业化。这是一个枯燥费时费力的工作。朱伟民花了一年多的时间不停地把细胞进行分离，然后进行杂交瘤融合，测试它们的稳定性。他做了几十回的亚克隆和融合稳定性试验的对比，后来终于获得了他满意的融合效率和稳定性更加出色的新细胞系，就是240E-W。这个W代表了伟民，也代表了开发这个技术的曲折道路。
柯耀煌是另外一位开发兔单克隆抗体技术的元老级老师。他是一个非常牛的抗体科学家，尤其是在兔抗领域，好几个著名抗体都有他的贡献。他是物理学的博士，非常聪明、特别爱动脑筋、很有想法，在蛋白质工程领域造诣很深，好多别人做不出来的抗体他都可以把它做出来。我们一起发明了很多的专利，包括兔抗的人源化，以及直接分离单个B细胞进行抗体基因测序等。柯耀煌老师为抗体业界做了很多非常好的抗体分子，贡献很大。
▋ 让兔单抗梦想照进现实
为了寻找一种新的抗体技术，我和几个朋友跑去单克隆抗体技术的发源地，英国剑桥的MRC（最早杂交瘤技术的开发出来的地方）拜访。在那里见到了著名的温特教授，他是用噬菌体文库筛选抗体的先驱。还认识了卡帕斯教授，他分离到一株人血液癌细胞，可以做人杂交瘤融合。现在想起来，如果我当时和卡帕斯教授合作的话，就没有我后来做兔单抗的故事了，我可能就做人单抗了。
2001年我们（我，朱伟民，张东晓和罗伯特·帕特拉）创办了致力于兔单克隆抗体开发的Epitomics公司。当然，创业总是不容易的。当时兔单抗技术最主要的难题就是杂交瘤要稳定性，朱伟民知道怎么提高杂交瘤的稳定。真正的技术只要好用就好，并不是要perfect，因为从来没有东西是perfect。如果这个东西真的很好了，成熟了，多半就有很多竞争对手了。后来，我们就开发成功了很多拥有开创性全球专利的兔单克隆抗体技术，并利用这一些核心技术开发生产了一系列的高质量兔单克隆抗体产品，目前已广泛应用于科研，诊断和新药领域。
▋ 兔单抗的优势与特点：高亲和力，高特异性，高灵敏度，多样性好，可以产生小鼠难以产生的抗体
我们说兔单克隆抗体质量好，理由之一就是好在抗体的亲和性高。现在的抗体的亲和力到10-10M或10-11M都比较常见，以前想要得到10-9M都很难，现在10-9M相对差了。我们通过对上千个单克隆抗体的比较，可以看出兔单抗的亲和力比鼠单抗的亲和力要高100倍左右。兔单抗的亲和力好，到底是好在与靶标的结合（K-on）还是解离（K-off)呢？我们研究发现，主要是好在解离，也就是抗体抗原两个分子分开的慢。
另外，兔单抗能够辨别表位差异的能力非常强，灵敏度很高。比如磷酸化的蛋白质与非磷酸化的（二者只是有一个磷的差别）；还有甲基化的差别，甚至能够区分一个甲基、两个甲基、还是三个甲基。后来，我们做了一大批兔单克隆抗体，能够非常精准的区分细胞内的蛋白或者细胞表面分泌的蛋白的一些蛋白修饰的差异。这些抗体都是科研人员非常想要的，对做表位分析至关重要，拿来做免疫组化学的结果也非常漂亮，当时没有其他更佳的办法可以做出来这一类抗体来。
▊ 兔单抗结构与功能特点的免疫遗传科学基础
为什么兔单抗有这些优点和特点，而且多样性这么好呢？这主要是基于兔子的免疫遗传学基础。
兔子的免疫系统和鼠的免疫系统是不同的。兔子在没有受到免疫刺激的时候就开始储备免疫功能的建立，在胚胎的时候叫新生免疫库（Neonatal Repertoire）；出生后已经有一定的B细胞，形成一级免疫库（Primary Repertoire），即第一批免疫细胞库；当兔子碰到抗原刺激后，就会发生重组和超级突变，形成二级免疫库（Secondary Repertoire）。
这就好比有的动物，像牛就有另外一个反刍胃来发挥消化和储存作用。兔子的免疫系统，也有些类似这个意思。由此兔子的免疫系统，一方面对很多抗原反应就比较快，另一方面产生的抗体多样性（Diversity）就更大。
我经常会把抗体的产生和成熟比喻为一次小小的进化，从最早应答免疫的B细胞开始，这个B细胞是不断进化的，不断重组突变并且不断被抗原的信号而筛选。我们可以在基因水平上把同源的抗体序列来跟初始的抗体基因序列做对比，就会发现免疫系统或抗体的成熟过程有完美的遗传进化树。
通过这些数据和信息的分析，我们就会知道哪些氨基酸是重要的，哪些氨基酸并不重要。这些知识和经验就会帮助和指导我们去做人源化改造，或者其他预期功能和用途的结构改造。信息越多，我们越能提高了我们开发的效率。
兔免疫系统的发展进化[2]
▋ 兔单抗技术的发展和趋势
兔单克隆抗体技术发展到今天，特别是大家看到兔单克隆抗体的优势以后，不少公司也试图开发兔抗技术。我们一直是两条路并行着走的：一是用不断优化的杂交瘤技术产生的兔单抗，另外就是获取抗体基因序列做重组兔单抗，也就是B细胞克隆技术。
我们当时在做兔杂交瘤单抗时，发现有的杂交瘤还是存在不稳定的问题。这不但影响了生产，成本相对也比较高。当时就提出能不能用基因克隆的办法，走出杂交瘤。
现在重组兔单抗技术已经很成熟，分离B细胞越来越快，全基因测序也越来越便宜，生物信息分析也非常先进，先在计算机上分析进化信息再做结构和功能，效率已经非常高了。所以现在大家用B细胞克隆开发兔单克隆抗体已经比较成熟和普遍了。
▋ 兔单克隆抗体，已在治疗性药物开发中崭露头角
基于杂交瘤兔单抗技术和重组兔单抗技术的发展和成熟，兔单抗技术已在人用治疗性药物的开发中初露锋芒。
2019年，全球批准了首个基于兔抗人VEGF单抗CDR和关键FR氨基酸改造的人源化scFv抗体，即Novartis公司的Brolucizumab（商品名Beovu），用于湿性老年性黄斑变性的治疗。这个药物的单抗原身就是当年Epitomics团队筛选出来的抗VEGF兔单抗之一。
目前，全球进入临床开发阶段的基于兔单抗的治疗性抗体药物约有9个（见表1）。可以看出，美国硅谷的Apexigen公司（Epitomics分拆出来的公司）和中国泰州医药城的荃信生物在该领域遥遥领先。
大家都知道，2003年，我们在杭州投资成立了宜康（杭州）生物技术有限公司。2008年起，就开始与国内生物制药领域的企业合作，共同研发和生产基于兔单抗全球专利技术的全新一代治疗性抗体药物。裘霁宛希望把兔单克隆抗体技术进行专科化和系列化的药物产品开发，造福病患。我和裘霁宛就联合创办了荃信生物公司。
荃信生物作为国内兔单抗药物的开拓者之一，专注于治疗免疫相关性疾病抗体药物的创新。目前，荃信有8个在研项目，目标适应症涵盖银屑病、特应性皮炎、类风湿关节炎、炎症性肠病、哮喘等。这其中有6个创新药项目，都是采用兔单抗技术开发的。当然，我们后面还会源源不断地推出创新产品。
Antibody mediated rejection
参考文献
[1] Spieker-Polet H, Sethupathi P, Yam P C, et al. Rabbit monoclonal antibodies: generating a fusion partner to produce rabbit-rabbit hybridomas[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(20):9348-9352.
[2] Knight K L, Crane M A. Generating the antibody repertoire in rabbit[J]. Adv Immunol,1994,56:179-218.
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